KAINOS

KAINOS

スイフトジーン®　セレウリド産生セレウス「カイノス」

  1. トップ
  2. 記事一覧
  3. 研究用試薬

スイフトジーン®　セレウリド産生セレウス「カイノス」の特徴

  • セレウリドを産生する生菌の遺伝子（mRNA）を検出
    ※キットは遺伝子の抽出・増幅・検出試薬を含みます
  • 食材から直接遺伝子を検出、培養不要
    ※最小検出感度：104cfu/g（食品）
    ※菌接種試験で確認した食品：
    米飯、チャーハン、おから、パスタ
  • 抽出～検出まで約1時間、目視判定
  • 増幅反応の成否をチェック
    ※インターナルコントロール（IC）ラインで確認します
  • セレウリド非産生セレウスは検出しません

    • 外観・判定例

    　　
    IC：インターナルコントロール
    r：リファレンス（検出フローの確認）
    ces： セレウリド産生セレウス検出　陽性
    ※ ces強度陽性の場合、ICラインは非常に薄くなる場合があります。

    本製品の開発は、厚生労働省の「食品の安全確保推進研究事業」における「食品中の毒素産生食中毒細菌および毒素の直接試験法の研究」の分担研究として実施されました。

    セレウスと食中毒

    セレウス（Bacillus cereus）は、土壌や河川水、農産物、畜産物、食料、飼料など自然界に広く分布しているグラム陽性、通性嫌気性の桿菌であり、芽胞形成能を有した菌です。

    セレウスによる食中毒は、その症状から「嘔吐型」と「下痢型」に大別されますが、日本におけるセレウス食中毒は「嘔吐型」がほとんどであり、その原因食品としては穀物およびその加工品（チャーハンやスパゲティなど）が最も多くなっています。

    嘔吐型食中毒の原因となる菌株は、ces遺伝子を有するサブグループに属し、セレウリドと呼ばれる嘔吐毒を産生します。このセレウリド産生セレウス株による食中毒の発症菌量は、食品1gあたり105～108個です。

    嘔吐型食中毒の主な症状は嘔吐で、潜伏期間30分～6時間で発症します。一般的に、経過良好で1～2日で回復しますが、まれに急性肝不全などで死亡する事例もあります。
    ＜グラム染色されたセレウス＞

    ページの一番上へ

    スイフトジーン®　セレウリド産生セレウス「カイノス」の測定原理

    A.核酸抽出

    界面活性剤と熱により検体中の菌体を破壊し、RNA を抽出します。

    B.核酸増幅　　 NASBA法の原理について

  • 核酸増幅法としては、NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) 法 を利用して、抽出した RNA 中のces mRNA を増幅します。
  • ces mRNA に特異的な2種類のプライマーと 3 種類の酵素（逆転写酵素、リボヌクレアーゼH、RNAポリメラーゼ）を用いて、41 ℃ の一定温度下で、鋳型に相補的な 1 本鎖 RNA を増幅します。
  • プライマー溶液には増幅反応の成否判定用としてインターナルコントロール(IC)のテンプレート及びプライマーが含まれており、検体中の ces mRNA の有無にかかわらず、同一チューブ内で IC の増幅反応が行われます。


    • C.核酸クロマトグラフィー

  • ces ラインの検出
    ces 増幅産物は、２種類のオリゴ DNA（着色ラテックス標識プローブおよびメンブレン固相プローブ）と配列特異的にサンドイッチハイブリダイゼーションすることで、クロマトストリップ上に青色ラインを形成します。このラインを目視で確認し、検体中のセレウリド産生セレウスの存在の有無を判定します。
  • ICラインの検出
    増幅反応の成否判定用である IC 増幅産物も、IC用の２種類のオリゴ DNA（着色ラテックス標識プローブおよびメンブレン固相プローブ）と配列特異的にサンドイッチハイブリダイゼーションすることで、クロマトストリップ上の ces の検出ラインとは異なる位置で青色ラインを形成します。
    増幅反応が阻害された場合、IC と ces の両方のラインが検出されません。
  • r ラインの検出
    ラテラルフロー確認用である赤色ラテックス標識プローブは、メンブレン固相プローブと配列特異的に結合することで、クロマトストリップ上に赤色ラインを形成します。
    ラテラルフローが正しく行われなかった場合、r のラインは検出されません。

    • ページの一番上へ

    試薬構成

    品番 品名 包装 貯法
    GP-6100
    (抽出・増幅試薬)    		 核酸抽出試液 4mL×1 20テスト 2～10℃
    NASBA試液 10回分×2
    プライマー溶液 110μL×1
    NASBA酵素試薬 10回分×2
    NASBA酵素溶解液 60μL×1
    反応用チューブ 20本
    GP-6200
    (検出試薬)    		 検出ストリップ 1本×20 20テスト 2～10℃
    展開液 2mL×1
    プレートシール 20枚

    キットの外観

    GP-6100(抽出・増幅試薬)
    GP-6200(検出試薬)
    ページの一番上へ

    使用方法

    ＜１＞食材試料の調製（10%乳剤）

    1) ストマフィルターに食品 25 ｇ と生理食塩水 225 mL を加え、ストマッカーで １ 分間処理します。

    ＜２＞核酸抽出前処理

    1) ストマフィルターでろ過された10 % 乳剤 1 mL を 1.5 mL チューブに入れます。
    2) 1890 G 以上で １ 分間遠心し、100 μL 相当の沈殿分または液量を残します。

    ＜３＞核酸抽出

    1) 核酸抽出試薬 200 μ Lを加えます。
    2) ボルテックスミキサーで 10 秒間混和して、沈殿物を十分に分散させます。
    3) ヒートブロック（90℃）で 5 分間 加熱します。
    4) ボルテックスミキサーで 5 秒間混和した後、1890 G 以上で 10 秒間遠心し氷上に静置します。（核酸抽出物）

    ＜４＞NASBA増幅

    1) NASBA反応溶液：NASBA 試薬 1 チューブにプライマー溶液を 55 μL 加え、直ちにボルテックスミキサーにて十分に溶解します。
    2) 付属の反応用チューブに NASBA 反応溶液を 5 μL 分注します。
    3) ＜2＞で得られた核酸抽出物 2.5 μL を 3) のチューブに分注します。分注後、10 回ピペッティングし、軽く遠心します。
    4) ヒートブロック(41℃)で 5 分間加温します。なお、この保温中に NASBA 酵素液を調製してください。
    5) NASBA酵素液：NASBA 酵素試薬に NASBA 酵素溶解液 30 μL を加え、10 秒程度待ってからタッピングにより、溶解します。
    6) ヒートブロック（41℃）上でチューブ内の反応液に、直接 NASBA 酵素液を 2.5 μL 添加し、5 回ピペッティングして混合します。
    7) ヒートブロック（41℃）で30 分間 加温します。

    ＜５＞核酸クロマト検出

    1) 増幅反応終了後のチューブに、展開液を 3 滴 滴下してください。
    2) チューブに検出ストリップを入れます。
    3) チューブに検出ストリップを入れてから 15 分後に結果を判定してください。

    ＜６＞判定例


    ※ ces強度陽性の場合、ICラインは非常に薄くなる場合があります。

    ページの一番上へ