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スイフトジーン®　CPE産生ウエルシュ菌「カイノス」

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スイフトジーン®　CPE産生ウエルシュ菌「カイノス」の特徴

  • CPE産生する生菌遺伝子(mRNA)を検出
    ※キットは遺伝子の抽出・増幅・検出試薬を含みます
  • 食材から直接遺伝子を検出、培養不要
    ※最小検出感度：105cfu/g（食品）
    ※菌接種試験で確認した食品：
    カレー、クリームシチュー、麻婆豆腐、八宝菜、 春巻き、肉じゃが、おから
  • 抽出～検出まで約1時間、目視判定
  • 増幅反応の成否をチェック
    ※インターナルコントロール（IC）ラインで確認します

    • 外観・判定例

    　　
    IC：インターナルコントロール
    r：リファレンス（検出フローの確認）
    CPE： CPE 産生ウエルシュ菌検出陽性
    ※ CPE 強度陽性の場合、ICラインは非常に薄くなる場合があります。

    本製品の開発は、厚生労働省の「食品の安心・安全確保推進研究事業」における「食品中の毒素産生食中毒細菌および毒素の直接試験法の研究」の分担研究として実施されました。

    ウエルシュ菌と食中毒

    ウエルシュ菌 (Clostridium perfringens, 旧学名 C. welchii) は、土壌や河川、海洋の泥など自然界に広く分布しているグラム陽性の偏性嫌気性菌です。

    ウエルシュ菌による食中毒は、多量 (108個以上) のエンテロトキシン (Clostridium perfringens enterotoxin, CPE) 産生ウエルシュ菌の生菌で汚染された食品を喫食することで発症します。

    日本における食中毒の原因食品としては、カレー等の煮込み料理や大量調理した食品で多く見られます。



    1） 調理した食品に菌が含まれていたとしても加熱調理する事で、多くの菌は死滅します。
    2） 耐熱性の芽胞を形成するウエルシュ菌は生き残ります。
    3） 食品の温度が増殖に適した温度まで低下すると、急速に増殖します。
    4） ウエルシュ菌の生菌を 106cfu/g以上含む食品を喫食すると、腹痛や下痢等の食中毒症状を起こします。
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    スイフトジーン®　CPE産生ウエルシュ菌「カイノス」の測定原理

    A.核酸抽出

    界面活性剤と熱により検体中の菌体を破壊し、RNA を抽出します。

    B.核酸増幅　　 NASBA法の原理について

  • 核酸増幅法としては、NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) 法 を利用して、抽出した RNA 中のcpe mRNA を増幅します。
  • cpe mRNA に特異的な2種類のプライマーと 3 種類の酵素（逆転写酵素、リボヌクレアーゼH、RNAポリメラーゼ）を用いて、41 ℃ の一定温度下で、鋳型に相補的な 1 本鎖 RNA を増幅します。

    • なお、増幅試薬には、増幅反応の成否判定用としてインターナルコントロール（IC） のテンプレート及びプライマーが含まれており、cpe mRNA の有無にかかわらず、同一チューブ内で IC の増幅反応が行われます。

    C.核酸クロマトグラフィー

  • CPE ラインの検出
    CPE 増幅産物は、２ 種類のオリゴ DNA（着色ラテックス標識プローブおよびメンブレン固相プローブ）と配列特異的にサンドイッチハイブリダイゼーションすることで、クロマトストリップ上に青色ラインを形成します。このラインを目視で確認し検体中の CPE 産生ウエルシュ菌の存在の有無を判定します。
  • ICラインの検出
    増幅反応の成否判定用である IC 増幅産物も、IC 用の ２ 種類のオリゴ DNA（着色ラテックス標識プローブおよびメンブレン固相プローブ）と配列特異的にサンドイッチハイブリダイゼーションすることで、クロマトストリップ上の CPE の検出ラインとは異なる位置で青色ラインを形成します。

    • 増幅反応が阻害された場合、IC と CPE の両方のラインが検出されません。

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    試薬構成

    品番 品名 包装 貯法
    GP-5100
    (抽出・増幅試薬)    		 核酸抽出試液 4mL×2 20テスト 2～10℃
    NASBA試液 10回分×2
    プライマー溶液 110μL×1
    NASBA酵素試薬 10回分×2
    NASBA酵素溶解液 60μL×1
    反応用チューブ 20本
    GP-5200
    (検出試薬)    		 検出ストリップ 1本×20 20テスト 2～10℃
    展開液 2mL×1
    プレートシール 20枚

    キットの外観

    GP-5100(抽出・増幅試薬)
    GP-5200(検出試薬)
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    使用方法

    ＜１＞食材試料の調製（10%乳剤）

    1) ストマフィルターに食品 25 ｇ と生理食塩水 225 mL を加え、ストマッカーで １ 分間処理します。

    ＜２＞核酸抽出前処理

    1) ストマフィルターでろ過された10 % 乳剤 1 mL を 1.5 mL チューブに入れます。
    2) 1890 G 以上で １ 分間遠心し、100 μL 相当の沈殿分または液量を残します。

    ＜３＞核酸抽出

    1) 核酸抽出試薬 400 μ Lを加えます。
    2) ボルテックスミキサーで 10 秒間混和して、沈殿物を十分に分散させます。
    3) ヒートブロック（90℃）で 5 分間 加熱します。
    4) ボルテックスミキサーで 5 秒間混和した後、1890 G 以上で 10 秒間遠心し氷上に静置します。（核酸抽出物）

    ＜４＞NASBA増幅

    1) NASBA反応溶液：NASBA 試薬 1 チューブにプライマー溶液を 55 μL 加え、直ちにボルテックスミキサーにて十分に溶解します。
    2) 付属の反応用チューブに NASBA 試液を 5 μL 分注します。
    3) ＜３＞で得られた核酸抽出物 2.5 μL を 2) のチューブに分注します。分注後、10 回ピペッティングし、軽く遠心します。
    4) ヒートブロック(41℃)で 5 分間加温します。なお、この保温中に NASBA 酵素液を調製してください。
    5) NASBA酵素液：NASBA 酵素試薬に NASBA 酵素溶解液 30 μL を加え、10 秒程度待ってからタッピングにより、溶解します。
    6) ヒートブロック（41℃）上でチューブ内の反応液に、直接 NASBA 酵素液を 2.5 μL 添加し、5 回ピペッティングして混合します。
    7) ヒートブロック（41℃）で30 分間 加温します。

    ＜５＞核酸クロマト検出

    1) 増幅反応終了後のチューブに、展開液を 3 滴 滴下してください。
    2) チューブに検出ストリップを入れます。
    3) チューブに検出ストリップを入れてから 15 分後に結果を判定してください。

    ＜６＞判定例

    ※CPE強度陽性の場合、ICラインは非常に薄くなる場合があります。
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