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NASBA Amplification キット

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特徴

  • 低温増幅反応(41℃)
  • RNAを特異的に増幅
  • 高感度(2-10 コピー)
  • 高効率(>109-10 in 90 min)
  • 高正確(High fidelity: >99.7 %)
  • 簡易検出(増幅産物:1本鎖 RNA)
  • 遺伝子発現量解析に有用
  • NASBA法の原理

  • プライマー:2種類
  • 酵素:3種類(AMV-RT、RNaseH、T7RNAP)
  • 増幅産物:アンチセンスRNA


  • NASBA法での増幅過程

    試薬構成

  • プライマーを除く、NASBA増幅用試薬セット
  • 高安定性:ヌクレオチド、酵素類が凍結乾燥品
  • 研究用試薬
  • 試薬構成:3試薬,各10本(5回×10)
    1. NASBA試薬:‥‥dNTPs,NTPs(凍結乾燥品)
      NASBA溶解液:‥‥トリス緩衝液,DMSO(溶液)
      NASBA酵素試薬:‥‥AMV-RT,RNaseH,T7 RNA polymerase(凍結乾燥品)

    用語解説

    AMV Reverse Transcriptase

    Reverse transcriptase (RT) は、DNA polymerase の一種で RNA依存性DNA polymerase活性及びDNA依存性DNA polymerase活性を持つ酵素である。即ち、一本鎖のDNAまたはRNAを鋳型とし、5’→ 3’方向に相補的なDNAを合成する。プライマーは RNA、DNA共に使用可能である。この酵素はRNase H活性を併せ持つ。AMVとはAvian myeloblastosis virusのことであり、本酵素は AMVから精製されている。

    RNase H

    RNase Hは、DNAとRNAのハイブリットRNAのみを分解するRNA分解酵素である。1本鎖 RNA は分解されない。酵素活性には2価のイオンが必須であり、RNAのホスホジエステル結合を解裂して5’-リン酸末端と3’-OH末端を生成する。逆転写酵素にも活性が確認されている。本酵素の活性は広く生体内に同定され、DNA複製に関与すると推定されているが、詳細な生物学的役割は不明である。

    T7 RNA polymarase

    大腸菌ファージT7の遺伝子産物で、約20塩基対からなるファージ固有のプロモーター配列を認識するRNA polymerase。5’→3’RNA polymerase活性を持ち、T7プロモーター配列を含む2本鎖の DNAを鋳型に、NTPを基質としてプロモーター下流の鋳型DNAの相補的RNAを合成する。

    使用方法

    20μL定性NASBA反応
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    準備として必要な試薬および器具

    試薬
    1 プライマー(2種)
    標的RNAに相補的なオリゴヌクレオチド
    アンチセンスプライマー5'側にT7 RNA polymerase配列付加
    5’-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG-3’
    2 Nuclease-free water:NASBA酵素試薬溶解用

    器具
    1 0.5mL マイクロチューブ(RNase-free)
    2 ヒートブロック(65℃, 41℃)
    3 ピペットマン等
    4 フィルターチップ
    5 ボルテックスミキサー
    6 卓上遠心器
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    測定プロトコール(20μL定性NASBA反応

    1 NASBA溶解液へ2種類プライマー添加 (各0.4μM) 60μL 0.4μM×100μL/*μM= μL
    * プライマーストック液濃度
    2 1)添加,NASBA試薬溶解(NASBA反応試薬調製)  
    3 2)NASBA反応試薬分注 10μL/本×5 本
    4 検体(RNA溶液)添加 5μL/本
    5 インキュベーション(変性) 65℃,5分
    6 インキュベーション(アニーリング) 41℃,5分
    7 6)インキュベーション中に酵素試薬溶解 30-55μL water/本
    8 7)酵素試薬添加(*温度低下注意) 5μL/tube
    9 インキュベーション(増幅反応) 41℃,90分
    10 反応終了後,検出までNASBA産物保存 -20℃以下

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    応用例

    Competitive NASBA

    原理

    既知濃度のQA(内部標準物質)を同時に増幅することで、コピー数未知の検体中のRNA量が定量可能です。QAは、WTの配列の一部を変更したcompetitorです。

    相関性(Relative RT-PCR法/Competitive NASBA法)

    MDR-1遺伝子の発現量をCompetitive NASBAとRelative RT-PCRで測定しました。
    Relative RT-PCRは、House Keeping Geneである、β2-ミクログロビン遺伝子の発現量を1.0とし、MDR-1遺伝子の発現量を示しました。

    検量線(Competitive NASBA法)

    Competitive NASBAでの検量線を示しました。WTが102 copies~107 copiesまで良好な直線性が得られました。
    増幅・検出には、Sandwich hybridization法を原理としたHybrigeneを用いました。

    RNA共存の影響(定量NASBA)

    共存RNAの影響を調べるため、健常人から抽出したTotal RNA1μg(ターゲットとなるMDR-1発現レベル:0)を添加し増幅・検出を行いました。
    10copiesから106copiesまで共存RNAの影響は認められませんでした。
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    検出例

    キャピラリー電気泳動装置による定性NASBA産物解析

    ドットブロットによる定性NASBA産物の検出

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